Étude de l'insuline humaine

1. Informations sur la séquence

Allez sur la page de WWW-Query. Sélectionnez les options Search for sequences et

Protein
databank

. Ensuite, choisissez la banque UniprotKB/SwissProt dans la liste déroulante. Pour composer votre requête, utilisez les critères suivants :

    DEFAULT     Keyword                     insulin
    AND         Species or taxon            homo sapiens

Cliquez ensuite sur le lien permettant de récupérer l'entrée SWISS-PROT correspondante (INS_HUMAN). Dans les annotations SWISS-PROT, localisez la table des features et notez les positions des chaînes A et B ainsi que du peptide C.

2. Récupération de la séquence sur le serveur

Afin de récupérer la séquence, revenez sur la page correspondant au résultat de votre requête effectuée dans SwissProt. Si cette page ne figure plus dans le cache de votre navigateur Web, composez de nouveau la requête décrite dans la section 1.

Une fois la page de résultat chargée, cliquez sur le bouton Retrieve. Le formulaire qui apparaît vous permet de récupérer toutes les séquences stockées dans une liste. Nous avons besoin de télécharger la séquence protéique de l'insuline au format FASTA, aussi utilisez les options suivantes :

    Sequence:   proteins
    Format:     Fasta
    Mode:       direct sending

Une fois que la séquence apparaît dans la fenêtre de votre navigateur, sauvez-la au format texte.

3. Recherche des homologues chez les vertébrés

Allez sur la page BLAST du PBIL pour effectuer une recherche de similarité dans les banques de séquences protéiques. La recherche doit être effectuée avec BLASTP dans la banque SWISS-PROT + TrEMBL. Collez la séquence de l'insuline humaine dans le formulaire puis modifiez les options de BLAST en utilisant les paramètres suivants :

    Expect:        1e-10
    Descriptions:  200
    Alignments:    200

Lancez la recherche. Sur la page de résultats, filtrez la sortie afin de ne conserver que les séquences de vertébrés non partielles. Pour ce faire, utilisez les options suivantes du menu

Filter your BLAST
results by taxon, keyword or date

    Taxon    IS      Vertebrates
    Keyword  IS NOT  partial

Apres filtrage, ne conservez que les séquences d'insuline d'une longueur supérieure à 70 acides aminés. Notez que les entrées annotées comme INS1, INS2, Preproinsulin ou Insulin precursor sont effectivement des insulines. Par contre, ne sélectionnez pas les entrées annotées comme Insulin-like growth factors ou les séquences trop courtes. Une fois ceci fait, cliquez sur le bouton Get selected sequences et sauvegardez-les dans un fichier texte. Nous utiliserons ces séquences dans la section 4 de cet exercice.

4. Alignement des séquences d'insuline

Pour aligner ces séquences, nous allons de nouveau utiliser SEAVIEW. Les étapes requises sont les suivantes :

Lancez SEAVIEW (e.g. en double-cliquant sur l'icone SEAVIEW, ou bien en tapant la commande seaview& dans une fenêtre Terminal).

Chargez l'ensemble des séquences d'insulines de vertébrés que vous avez sauvegardées au cours de l'étape 3 de cet exercice. Pour ce faire, utilisez l'option Open du menu File.

Lancez le calcul de l'alignement en utilisant l'option Align all du menu Align (ceci ouvre une fenetre de commande dans laquelle le programme MUSCLE va effectuer l'alignement). Cliquez sur le bouton OK pour charger l'alignement nouvellement calculé dans SEAVIEW.

Repérez les séquences incomplètes ou chimériques. Vous pouvez les sélectionner (cliquez sur leur nom dans le panneau de gauche) puis les supprimer (menu Edit -> Delete sequences).Vous pouvez ensuite supprimer les gaps inutiles (menu Edit -> Del. gap-only sites).

Sous SeaView, localisez dans l'alignement les bornes des chaînes A et B ainsi que du peptide C de l'insuline humaine. Comparez le degré de conservation des séquences de ces trois domaines chez l'ensemble des vertébrés. Que constatez vous ?

5. Phylogénie des insulines de vertébrés

Calculez une phylogénie de ces séquences (menu Trees de SEAVIEW) en utilisant la méthode de distance BioNJ avec la distance de Poisson et 500 réplicats de bootstrap. Une fois l'arbre calculé, racinez-le avec la séquence de la Myxine (INS_MYXGL).

Que pensez-vous de la topologie de cet arbre en fonction de ce que vous savez de l'histoire évolutive des vertébrés ? Pour ce qui est de la correspondance entre les identifiants de séquences et les espèces, utilisez liens suivants: Classement par taxon ou Classement par séquence. Par ailleurs, les regroupements observés sont-ils soutenus ?

Identifiez les espèces contenant des paralogues pour l'insuline. Dans quels grands groupes taxonomiques se situent-elles ?
Re-calculez la phylogénie de ces séquences (menu Trees de SEAVIEW) en utilisant la méthode de maximum de vraisemblance PhyML avec les paramètres par défaut. Comparez l'arbre avec celui obtenu par BioNJ.

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